本发明提供了一种利用超临界流体色谱与反相高效液相色谱相结合的方法分离制备化学合成的甲基化EGCG粗产物，其是以EGCG为底物，硫酸二甲酯为甲基化试剂，采用化学方法合成甲基化EGCG，利用反相高效制备液相色谱与超临界流体色谱对化学合成粗产物进行进一步的分离制备，得到EGCG4″Me、3′,4″-di-O-methyl-EGCG和4′,4″-di-O-methyl-EGCG三种甲基化EGCG单体，产品的纯度达到97%以上。
1.一种甲基化EGCG的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将EGCG：硫酸二甲酯：K₂CO₃按摩尔比为1:2.5:10的比例加入到锥形瓶中，加入丙酮溶液，氮气作为保护气体，超声波超声2～5小时，过滤，真空浓缩，乙酸乙酯萃取，浓缩冷冻干燥，得到甲基化EGCG粗产物；S2.利用反相高效制备液相色谱与超临界流体色谱对甲基化EGCG粗产物进行进一步的分离制备，得到4″-甲基EGCG、3′,4″-二甲基EGCG、4′,4″-二甲基EGCG三种甲基化EGCG单体；其中，所述步骤S2包括：S21.将步骤S1得到的甲基化EGCG粗产物用甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤，利用反相高效制备液相色谱进行分离制备，分别收集各个色谱峰，参考标准品色谱峰，真空浓缩干燥，得到4″-甲基EGCG单体与3′,4″-二甲基EGCG和4′,4″-二甲基EGCG的混合物；S22.将混合物溶解后采用超临界流体色谱进行分离精制，收集2个色谱峰，浓缩干燥，得到3′,4″-二甲基EGCG单体和4′,4″-二甲基EGCG单体；所述步骤S21反相高效制备液相色谱进行分离制备的色谱条件为：流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱程序为：0～21min，B泵乙腈维持15％，21～23min，15％B线性升至20％B，保持7min后于2min内降至15％B；流速15-100mL/min；检测波长265nm；柱温30℃；进样量500-2000μL；所述步骤S22超临界流体色谱进行分离精制的色谱条件为：柱温35℃；检测波长214nm；流动相：二氧化碳/乙醇＝50/50；循环时间：
13.6min；流速：120mL/min；背压：100Bar；单针进样量：60mg。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S21反相高效制备液相色谱进行分离制备的色谱柱为：Shimadzuxa0PRC-ODSxa0C18反相色谱柱，内径20-50mm，长度250mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S22超临界流体色谱进行分离精制的色谱柱为：CHIRALPAKxa0AD-H制备型手性异构柱：Daicel，250mm×50mm，5μm。技术领域
本发明涉及化合物制备领域，具体地说，涉及一种甲基化EGCG的制备方法。
背景技术
二十世纪90年代末期，日本研究者最早成功从台湾冻顶乌龙中分离鉴定出两种具有抗过敏功能的新型儿茶素衍生物，其分子结构为(-)-表没食子儿茶素-3-O(4-O-甲基)没食子酸酯（EGCG4″Me）和(-)-表没食子儿茶素-3-O(3-O-甲基)没食子酸酯（EGCG3″Me）。随着这两种甲基化EGCG的出现，人们对甲基化EGCG的化学合成、酶法合成以及EGCG在老鼠和人体内的代谢产物进行了更深入的研究，发现了更多的甲基化EGCG，但目前对于甲基化EGCG药理功效的研究主要集中在EGCG4″Me和EGCG3″Me。过敏性疾病是发病率较高的一种常见病，可严重地影响到患者的生活质量、工作、学习效果，也会因此造成经济损失。日本约有三分之一以上的人对花粉过敏。随着人们饮食习惯的改变，生活和工作压力的增大，环境污染，过敏性疾病在全界范围内呈逐年增加的趋势，已成为全世界各国政府部门高度关注的全球健康问题之一。世界变态反应组织（Worldxa0Allergyxa0Organization,WAO）在世界首个过敏性疾病日（2005年7月8日）公布了对30个国家进行过敏性疾病病学的调查结果表明：在这些国家12亿人口中，22%（2.5亿人）患有免疫球蛋白E（IgE）介导的过敏性疾病，如花粉过敏、过敏性鼻炎、结膜炎、哮喘、湿疹、药物过敏、食物过敏等，世界卫生组织（WHO）将过敏性疾病列为“21世纪重点研究和预防的疾病”。目前治疗过敏性疾病的药物多为化学合成药，如变态反应介质阻释剂、抗组胺药、激素类药等，这些化学合成药副作用大，价格高。由于生活环境的改变，过敏患者数量剧增，然而过敏性疾病的治疗需要长期坚持，希望开发对人体没有副作用的食品或保健品使过敏症状减轻，因此迫切需要研究从天然植物中开发高效、低毒、副作用小的天然抗过敏药物或保健品，此举措已成为世界开发天然抗过敏新药剂和保健食品的重要研究方向，避免了西药复发率高、不去根、作用环节单一、有不良反应等缺点。然而，EGCG3″Me和EGCG4″Me对抗过敏，尤其是花粉过敏具有非常显著地效果。自从日本研究者发现Benifuuki绿茶和台湾冻顶乌龙茶中含有EGCG4″Me和EGCG3″Me以来，Benifuuki茶叶在日本市场上的售价是其他茶叶的2～3倍且供不应求，EGCG4″Me和EGCG3"Me纯品售价高达每毫克1800元人民币。国际医药与保健品行业均认为甲基化EGCG非常有可能发展为一个独立茶树品种，成为新的儿茶素经济增长点而为社会带来巨额财富。但富含EGCG4"Me和EGCG3"Me的茶树品种甚少，含量也非常低，特别是EGCG4″Me在多个茶树品种中未检出，面对这种形式，为了开展更多有关甲基化EGCG功效研究，亟需一种高效制备甲基化EGCG的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种甲基化EGCG的制备方法。技术方案如下：一种甲基化EGCG的制备方法，包括如下步骤：S1.将EGCG：硫酸二甲酯：K₂CO₃按摩尔比为1:2.5:10的比例加入到锥形瓶中，加入丙酮溶液，氮气作为保护气体，超声波超声2～5小时，过滤，真空浓缩，乙酸乙酯萃取，浓缩冷冻干燥，得到甲基化EGCG粗产物，采用分析型高效液相色谱对粗产物进行分析，超声5小时粗产物的色谱图如图1所示；S2.利用反相高效制备液相色谱与超临界流体色谱对甲基化EGCG粗产物进行进一步的分离制备，得到EGCG4″Me、3′,4″-di-O-methyl-EGCG、4′,4″-di-O-methyl-EGCG三种甲基化EGCG单体。进一步地，所述步骤S2包括：S21.将步骤S1得到的甲基化EGCG粗产物用甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤，利用反相高效制备液相色谱进行分离制备，分别收集各个色谱峰，参考标准品色谱峰，真空浓缩干燥，得到EGCG4″Me单体与3′,4″-di-O-methyl-EGCG和4′,4″-di-O-methyl-EGCG的混合物；S22.将混合物溶解后采用超临界流体色谱进行分离精制，收集2个色谱峰，浓缩干燥，得到3′,4″-di-O-methyl-EGCG单体和4′,4″-di-O-methyl-EGCG单体。更进一步地，所述步骤S21反相高效制备液相色谱进行分离制备的色谱条件为：流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱程序为：0～21min，B泵乙腈维持15%，21～23min，15%B线性升至20%B，保持7min后于2min内降至15%B；流速15-100mL/min；检测波长265nm；柱温30℃；进样量500-2000μL。之后，收集反相高效制备液相色谱各个色谱峰，色谱图见图2，以分析型高效液相色谱进行分析，并与标准品的出峰时间（保留时间）进行比对，确定1号峰为EGCG（化合物A）、2号峰为EGCG4″Me（化合物B），3号峰为未知混合物，是甲基化EGCG粗产物的化合物C和化合物D。将收集的各个色谱峰进行真空浓缩干燥与HPLC分析，HPLC的色谱条件如下：色谱柱：Welchromxa0C₁₈(250mm×4.6mm5μm)；色谱条件：流动相为KH₂PO₄磷酸缓冲液（0.02mol/L，pH=2.5）-乙腈溶液，梯度洗脱程序：0～15min，B泵乙腈维持13%，15～25min，13%B线性升至20%B，保持15min后于2min内降至13%B；流速：1.0mL/min；进样量10μL；波长265nm；柱温30℃。作为优选，所述步骤S21反相高效制备液相色谱进行分离制备的色谱柱为：Shimadzuxa0PRC-ODSxa0C₁₈反相色谱柱，内径20-50mm，长度250mm。更进一步地，所述步骤S22超临界流体色谱进行分离精制的色谱条件为：柱温35℃；检测波长214nm；流动相：二氧化碳/乙醇=50/50；循环时间：13.6min；流速：120mL/min；背压：100Bar；单针进样量：60mg。之后，收集2个色谱峰，浓缩干燥，其色谱图如图3所示，采用UV、HPLC-MS、NMR对其进行结构鉴定与分析，鉴定其分别为3′,4″-di-O-methyl-EGCG、4′,4″-di-O-methyl-EGCG，纯度达到97%以上，分别对应于图1中的化合物C和化合物D。作为优选，所述步骤S22超临界流体色谱进行分离精制的色谱柱为：CHIRALPAKxa0AD-H制备型手性异构柱：Daicel，250mm×50mm，5μm。本发明的有益效果在于：1、本发明首次采用超临界流体色谱分离制备甲基化EGCG；2、产品的纯度达到97%以上；3、本发明采用化学方法合成甲基化EGCG，利用反相高效制备液相色谱和超临界流体色谱相结合的方法对合成的粗产物进行分离纯化，得到高含量的甲基化EGCG。工艺稳定性好，不需采用其他中间步骤。
附图说明
图1为本发明化学合成甲基化EGCG粗产物的HPLC图谱；其中：峰A为EGCG、峰B为EGCG4″Me、峰C为3′,4″-di-O-methyl-EGCG、峰D为4′,4″-di-O-methyl-EGCG。图2为本发明粗产物的高效制备液相色谱图；其中：峰1为EGCG（化合物A）、峰2为EGCG4″Me（化合物B）、峰3为峰3′,4″-di-O-methyl-EGCG（化合物C）和4′,4″-di-O-methyl-EGCG（化合物D）混合物。图3为本发明超临界流体色谱分离的化合物C和化合物D的色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1称取95%的EGCG7.33g、K₂CO₃22.11g，分别加入丙酮溶液800mL和硫酸二甲酯4mL（密度为1.333g/mL），冲入氮气，超声波超声2小时，过滤，真空浓缩，加入350mL乙酸乙酯萃取2次，浓缩冷冻干燥，得到合成的甲基化EGCG粗产物4.94g。将粗产物用甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤，上制备型高效液相色谱，采用如下制备色谱条件：Shimadzuxa0PRC-ODSxa0C₁₈反相色谱柱，内径20mm，长度250mm；流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱程序为：0～21min，B泵乙腈维持15%，21～23min，15%B线性升至20%B，保持7min后于2min内降至15%B；流速15mL/min；检测波长265nm；柱温30℃；进样量500μL。分别收集各个色谱峰并与标准品色谱峰的保留时间进行比对，峰1为EGCG（化合物A）0.38g，纯度为98.8%、峰2为EGCG4″Me（化合物B）1.53g，纯度为98.2%，峰3为未知物化合物C和化合物D的混合物0.24g，利用超临界流体色谱进一步进行分离制备。采用如下超临界流体色谱条件：CHIRALPAKxa0AD-H制备型手性异构柱（Daicel，250mm×50mm，5μm）；流动相：二氧化碳/乙醇=50/50；柱温35℃；检测波长214nm；循环时间：13.6min；流速：120mL/min；背压：100Bar；单针进样量：60mg。分别收集2个色谱峰，浓缩干燥，采用UV、HPLC-MS、NMR对其进行结构鉴定与分析，鉴定其分别为3′,4″-di-O-methyl-EGCG（化合物C）0.057g，纯度为97.6%、4′,4″-di-O-methyl-EGCG（化合物D）0.164g，纯度为98.1%。实施例2称取95%的EGCG13.75g、K2CO341.45g，分别加入丙酮溶液1500mL和硫酸二甲酯7.5mL（密度为1.333g/mL），冲入氮气，超声波超声3小时，过滤，真空浓缩，加入500mL乙酸乙酯萃取2次，浓缩冷冻干燥，得到合成的甲基化EGCG粗产物9.31g。将粗产物用甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤，上制备型高效液相色谱，采用如下制备色谱条件：Shimadzuxa0PRC-ODSxa0C₁₈反相色谱柱，内径30mm，长度250mm；流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱程序为：0～21min，B泵乙腈维持15%，21～23min，15%B线性升至20%B，保持7min后于2min内降至15%B；流速40mL/min；检测波长265nm；柱温30℃；进样量1000μL。分别收集各个色谱峰采用分析型高效液相色谱对其进行分析，并与标准品色谱峰的保留时间进行比对，峰1为EGCG（化合物A）0.64g，纯度为97.5%、峰2为EGCG4″Me（化合物B）2.61g，纯度为98.8%，峰3为未知物化合物C和化合物D的混合物0.58g，利用超临界流体色谱进一步进行分离制备。采用如下超临界流体色谱条件：CHIRALPAKxa0AD-H制备型手性异构柱（Daicel，250mm×50mm，5μm）；流动相：二氧化碳/乙醇=50/50；柱温35℃；检测波长214nm；循环时间：13.6min；流速：120mL/min；背压：100Bar；单针进样量：60mg。分别收集2个色谱峰，浓缩干燥，采用UV、HPLC-MS、NMR对其进行结构鉴定与分析，鉴定其分别为3′,4″-di-O-methyl-EGCG（化合物C）0.15g，纯度为98.32%、4′,4″-di-O-methyl-EGCG（化合物D）0.38g，纯度为98.56%。实施例3称取95%的EGCG22.92g、K₂CO₃69.1g，分别加入丙酮溶液3000mL和硫酸二甲酯12.5mL（密度为1.333g/mL），冲入氮气，超声波超声5小时，过滤，真空浓缩，加入800mL乙酸乙酯萃取2次，浓缩冷冻干燥，得到合成的甲基化EGCG粗产物15.41g。将粗产物用甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤，上制备型高效液相色谱，采用如下制备色谱条件：Shimadzuxa0PRC-ODSxa0C₁₈反相色谱柱，内径50mm，长度250mm；流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱程序为：0～21min，B泵乙腈维持15%，21～23min，15%B线性升至20%B，保持7min后于2min内降至15%B；流速100mL/min；检测波长265nm；柱温30℃；进样量2000μL。分别收集各个色谱峰采用分析型高效液相色谱对其进行分析，并与标准品色谱峰保留时间进行比对，峰1为EGCG（化合物A）0.84g，纯度为97.9%、峰2为EGCG4″Me（化合物B）3.56g，纯度为98.6%，峰3为未知物化合物C和化合物D的混合物2.6g，利用超临界流体色谱进一步进行分离制备。采用如下超临界流体色谱条件：CHIRALPAKxa0AD-H制备型手性异构柱（Daicel，250mm×50mm，5μm）；流动相：二氧化碳/乙醇=50/50；柱温35℃；检测波长214nm；循环时间：13.6min；流速：120mL/min；背压：100Bar；单针进样量：60mg。分别收集2个色谱峰，浓缩干燥，采用UV、HPLC-MS、NMR对其进行结构鉴定与分析，鉴定其分别为3′,4″-di-O-methyl-EGCG（化合物C）0.78g，纯度为98.1%、4′,4″-di-O-methyl-EGCG（化合物D）1.65g，纯度为99.1%。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。